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:HPLC法同時測定生發片中二苯乙烯苷和特女貞苷的含量

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目的:建立HPLC同時測定生發片中二苯乙烯苷和特女貞苷含量的方法。方法:樣品用70%甲醇超聲提取
  

  【摘 要】 目的:建立HPLC同時測定生發片中二苯乙烯苷和特女貞苷含量的方法。方法:樣品用70%甲醇超聲提取。色譜柱:Inertsil ODS-3-C18(5μm,250mm×4.6mm);流動相:乙腈-水(17∶83);檢測波長:224nm;流速:1.0ml/min;進樣量:10ml。結果:二苯乙烯苷在0.01618~0.2426mg范圍內線性關系良好(r=0.9999),平均加樣回收率為100.1%(n=6),RSD=1.84%;特女貞苷在0.0816~1.224mg范圍內線性關系良好(r=0.9998),平均加樣回收率為100.6%(n=6),RSD=1.38%。結論:本方法簡單、準確,可作為生發片的質量控制方法。
【關鍵詞】 生發片;二苯乙烯苷;特女貞苷;高效液相色譜法;含量測定
本文應用《中國民族民間醫藥
生發片收載于《中藥成方制劑》第十七冊[1],由何首烏、女貞子、山藥、黑棗、黑豆、茯苓、牡丹皮、地黃、墨旱蓮、澤瀉、桑葚、麥冬12味中藥組成,具有滋補肝腎、益氣養血、生發烏發之功效,主要用于肝腎不足、氣血虧虛所致的頭發早白、脫落、斑禿、全禿和脂溢性脫發。二苯乙烯苷是何首烏特有的生物活性成分[2],研究表明二苯乙烯苷能夠誘導小鼠 B16 細胞色素沉著[3],并且通過誘導休眠毛囊進入生長期促進頭發的生長[4]。特女貞苷是女貞子中重要的水溶性活性成分[5],女貞子水煎劑能增強小鼠毛囊肝細胞生長因子(HGF)和血管內皮細胞生長因子(VEGF)mRNA的表達,對體外培養的小鼠觸須毛囊有明顯的促生長作用[6-7]。生發片原標準中只有還原糖的鑒別,無含量測定項,為了更好地控制生發片的質量,研究采用HPLC同時測定了本品中二苯乙烯甘和特女貞苷含量。
1 儀器與材料
1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀(VWD檢測器,Agilent1200化學工作站);賽多利斯BSA224S-CW型電子天平(精確度為十萬分之一);SB-4200 DTD超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司);HH-4數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)。
1.2 材料 特女貞苷對照品(批號:111926-201404)、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品(批號:110844-201512)購自中國食品藥品檢定研究院;生發片(批號:1512079 T家);乙腈為色譜純;水為超純水;其他試劑為分析純。
2 方法與結果
2.1 色譜條件 色譜柱:Inertsil ODS-3-C18(5μm,250mm×4.6mm);流動相:乙腈-水(17∶83);柱溫:25℃;流速:1.0ml/min;檢測波長:224nm;進樣量:10ml。
2.2 溶液制備
2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取特女貞苷和二苯乙烯苷對照品適量,置25ml容量瓶中,加70%甲醇溶解定容到刻度,搖勻,配成質量濃度分別為1.02和0.202mg/ml的特女貞苷和二苯乙烯苷混合對照品儲備液。精密吸取上述儲備液1.0ml置10ml容量瓶中,加70%甲醇定容至刻度,搖勻,即得0.102mg/ml的特女貞苷和0.0202mg/ml的二苯乙烯苷混合對照品溶液。
2.2.2 供試品溶液的制備 取本品20片,除去包衣,精密稱定,研細,取約4.0g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50ml 70%甲醇,稱定重量,超聲(功率 400W,頻率 40kHz)30min,放冷,再稱定重量,用70%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。
2.2.3 陰性對照溶液的制備 按照生發片的制備工藝,分別制備不含何首烏和女貞子的陰性樣品,參照供試品溶液的制備方法同法操作,制備陰性對照溶液。
2.3 方法學考察
2.3.1 系統適用性試驗 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液,按照“2.1” 項下的色譜條件進行試驗。記錄色譜圖,理論塔板數按二苯乙烯苷峰計不低于6000,按特女貞苷峰計算不低于7000;二苯乙烯苷和特女貞苷與其他組分的分離度均>1.5;供試品溶液中二苯乙烯苷和特女貞苷的色譜峰與對照品溶液一致,陰性對照無干擾。結果見圖1。
2.3.2 線性關系考察 分別精密吸取“2.2.1”項下的對照品儲備液0.2、0.3、0.5、1、2、3ml,置25ml容量瓶中,加70%甲醇定容至刻度,按“2.1”項下的色譜條件進行測定,以混合對照品的進樣量(mg)為橫坐標,峰面積積分值為縱坐標,繪制標準曲線,得到二苯乙烯苷的回歸方程為Y=3787.6X+1.4319,r=0.9999;特女貞苷的回歸方程為Y=985.26X+5.5701,r=0.9998。線性范圍分別為0.01618~0.2426mg、0.0816~1.224mg,結果表明,各成分在各自濃度范圍內具有良好的線性關系。
2.3.3 精密度試驗 精密吸取“2.2.1” 項下的對照品溶液, 按“2.1”項下的色譜條件分別連續進樣6次,測得二苯乙烯苷峰面積的RSD=0.33%、特女貞苷峰面積的RSD=0.12%,結果表明精密度良好。
2.3.4 重復性試驗 取生發片(批號:1512079),按照“2.2.2”項下的方法,平行制備6份供試品溶液,按“2.1”項下的色譜條件,分別測定含量。得二苯乙烯苷和特女貞苷的平均含量分別為0.1643mg/g、1.5631mg/g,RSD分別為0.71%、1.2%,結果表明重復性良好。
2.3.5 穩定性試驗 取生發片(批號:1512079),按照“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液,分別在制備后的第0、2、4、6、8、12h進樣,記錄二苯乙烯苷和特女貞苷的峰面積,計算RSD分別0.34%和0.92%,結果表明,供試品溶液在12h內穩定性良好,能夠滿足試驗要求。
2.3.6 加樣回收試驗 精密稱定已知含量的生發片(批號:1512079,二苯乙烯苷含量約為0.3286mg、特女貞苷含量約為3.1262mg)6份,每份約2.0g,精密加入混合對照品溶液(含二苯乙烯苷0.06604mg/ml、特女貞苷0.6252mg/ml)5ml,按照“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液,按“2.1”項下的色譜條件,分別進行含量測定,計算回收率。結果二苯乙烯苷的平均回收率為100.1%,RSD=1.84%;特女貞苷的平均回收率為100.6%,RSD=1.38%。
2.4 樣品測定 取5批供試品,按照“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液,在“2.1”項下的色譜條件下進行進樣分析,測定二苯乙烯苷和特女貞苷的含量,結果見表1。
3 討論
3.1 流動相的選擇 分別對甲醇-水、乙腈-水和乙腈-酸三個流動相系統進行了考察,結果乙腈-水系統的分離度和峰形均比甲醇-水系統好,乙腈-酸系統和乙腈-水系統差別不大,考慮到色譜柱的使用壽命和操作問題,選擇乙腈-水做為流動相。
3.2 檢測波長的選擇 分別用70%甲醇配制二苯乙烯苷和特女貞苷的對照品溶液,在波長200~400nm范圍內掃描,圖譜顯示在224nm處特女貞苷有最大吸收,二苯乙烯苷在224nm和320nm處均與較強吸收,因此,選擇224nm作為檢測波長。見圖2。
3.3 對提取溶劑的考察 比較了甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇和稀乙醇在相同提取條件下對二苯乙烯苷和特女貞苷的提取率,結果表明,70%甲醇和甲醇的提取率均較高,考慮到生產成本,確定70%甲醇為提取溶劑。
3.4 提取方法和提取時間的考察 比較了超聲和加熱回流兩種提取方法對二苯乙烯苷和特女貞苷提取率的影響,結果表明,兩種方法的提取率接近,由于超聲提取的操作更加簡單,所以選擇超聲提取。分別對15、30、45、60min超聲時間做了對比,結果顯示30min即可將上述兩種成分提取完全,所以將超聲時間定為30min。
綜上所述,本方法可以簡單快速地測定生發片中二苯乙烯苷和特女貞苷的含量,專屬性強,靈敏度高,重復性好,可以更好地控制生發片質量標準性,同時為含有何首烏和女貞子的制劑質量標準的建立提供參考,可以提高分析效率,降低分析成本。
參考文獻
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[2] 徐杰,周文聰,張媛英. 何首烏活性成分—二苯乙烯苷的研究進展[J].泰山醫學院學報,2008,29(1):78-80.
[3] 姜澤群,吳瓊,徐繼敏,等. 中藥何首烏促進黑色素生成的作用機理研究[J]. 南京中醫藥大學學報,2010,26(3):190-192.
[4] Park H J, Zhang N, Park D K. Topical application of Polygonum multiflorum extract induces hair growth of resting hair follicles through up regulating Shh and β-catenin expression in C57BL/6 mice [J]. Ethnopharmacol, 2011, 135(2): 369-375.
[5]高素強,周舒君,曹紀亮,等. 中藥女貞子化學成分及質量控制方法的研究進展[J]. 中南藥學,2012,(11):835-838.



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